據(jù)報(bào)道，美國(guó)異體骨移植患者的人類免疫缺陷病毒感染率為1／160萬(wàn)。近些年來(lái)人造材料，如羥基磷灰石、硫酸鈣等已用于骨缺損的填充，然而實(shí)際效果遜于自體或異體骨，為此，人們正在探索新的途徑和技術(shù)來(lái)破解骨缺損治療的臨床難題。3D打印技術(shù)的興起或許可以為解決上述難題帶來(lái)希望。

3D生物打印是組織工程學(xué)的一種高速仿形技術(shù)，以計(jì)算機(jī)三維設(shè)計(jì)模型為藍(lán)本，利用激光引導(dǎo)、噴墨打 印等技術(shù)，將生物材料通過(guò)逐層堆積粘結(jié)，疊加塑型，最終形成仿真的組織或器官。1999年，Winder等 利用CT掃描并三維重建出顱骨缺損的外形，并應(yīng)用3D打印技術(shù)快速打印出合適形狀、大小鈦金屬植入體，用 于治療患者顱骨缺損并獲得成功。Igawa等則利用3D打印技術(shù)成功打印出磷酸三鈣植入骨，修復(fù)了狗顱骨缺損部位。骨組織3D打印需要合適的聚合材料，在組織打印過(guò)程中能夠保護(hù)細(xì)胞功能完整，同時(shí)保證打印后組織內(nèi)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸及廢物的排出。如何構(gòu)建3D骨模型、自然成骨、促進(jìn)骨愈合、提高細(xì)胞成活率以及減少免疫原性，成為骨組織3D打印亟需解決和突破的重要研究課題。綜合現(xiàn)有研究工作和進(jìn)展，我們歸納出理想的3D骨組織打印的雛形：

（1）以骨骼缺損為原型，以生物可吸收高分子化合物為材料，快速打印出具有骨硬度、多孔、利于細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)支架；

（2）細(xì)胞可黏附于支架并能增殖、分化成骨，支架的多孔結(jié)構(gòu)有利于氧氣及營(yíng)養(yǎng)的供給，有利于骨組織生長(zhǎng)及血管新生，并可避免應(yīng)力屏蔽效應(yīng)；

（3）生物支架可提供細(xì)胞生長(zhǎng)分化所需的細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)血管新生、骨形態(tài)發(fā)生蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，為細(xì)胞成骨提供持續(xù)的微環(huán)境。這一技術(shù)可能是骨再生最有效的方法，甚至可能實(shí)現(xiàn)完美的骨重建和關(guān)節(jié)重塑。

1. 3D打印骨組織的生物支架

生物支架是3D骨組織打印的基本框架，需具備易打印性、與缺損部分的契合性、良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)性、力學(xué)穩(wěn)定性、可塑性、生物降解性等特性，目前主要有金屬、生物陶瓷、聚合材料、聚合材料與生物陶瓷或金屬與生物陶瓷的復(fù)合材料作為備選。

1.1 金屬支架

鈦合金質(zhì)輕、強(qiáng)度高且具有優(yōu)良的生物相容性，是理想的植入人體的植入物。將前成骨細(xì)胞種植鈦合金支架上培養(yǎng)，可檢測(cè)到纖維連接蛋白、黏著斑蛋白、細(xì)胞數(shù)量、堿性磷酸酶、細(xì)胞外基質(zhì)鈣化結(jié)節(jié)均增加，顯示 多孔結(jié)構(gòu)的鈦合金支架可促進(jìn)前成骨細(xì)胞黏附、增殖、分化、礦化 。我們將多孔的3D打印鈦合金移植物植入羊的C3－C5椎體，通過(guò)微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（microcomputedtomography，Miro－CT）掃描重建及組織染 色均可觀察到大量骨組織長(zhǎng)入移植物內(nèi)。雖然3D打印金屬支架生物相容性好、抗壓能力強(qiáng)，但金屬支架打印需要在高溫條件下進(jìn)行，支架打印時(shí)不能同步涂層生物活性分子或細(xì)胞混合打印。

1.2 生物陶瓷支架

生物陶瓷具有抗壓能力強(qiáng)、生物相容性好、骨誘導(dǎo)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于組織工程研究。目前主要有磷酸鈣、磷酸二正硅酸鈣、雙相磷酸鈣、硅酸鈣／β－磷酸三鈣等材質(zhì)的陶瓷支架， 其抗壓強(qiáng)度可達(dá)到松質(zhì)骨生物力學(xué)要求。3D打印的陶瓷支架可促進(jìn)細(xì)胞成骨性分化和血管新生。羥基磷灰石支架可促進(jìn)牙神經(jīng)鞘干細(xì)胞成骨性分化，雙相磷酸鈣支架中β－磷酸三鈣的含量增加可促進(jìn)細(xì)胞成骨性 分化，硅酸鈣／β－磷酸三鈣支架中硅元素釋放可促進(jìn)成骨樣細(xì)胞合成BMP－2、TGF－β發(fā)揮成骨作用。 NAGEL支架促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管形成。雖然陶瓷支架生物相容性好、骨誘導(dǎo)能力強(qiáng)、抗壓性能好，但是陶瓷支架同樣需要高溫下進(jìn)行打印，打印時(shí)不能 對(duì)支架同步涂層促進(jìn)骨形成的生物活性分子或抗感染的藥物 ，同時(shí)其脆性高、韌性差、剪切應(yīng)力弱。

1.3 聚合材料支架

聚合材料具有促進(jìn)細(xì)胞成骨性分化、細(xì)胞黏附、可控降解等優(yōu)點(diǎn)，亦被廣泛用于組織工程研究，如聚乙二醇、聚乳酸、聚己內(nèi)酯等。聚己內(nèi)酯支架與骨髓干細(xì)胞共打印，體外研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶、骨鈣素、Ⅰ型膠原增加，將含有人重組骨形成蛋白的聚己 內(nèi)酯支架植入兔子尺骨中段骨折部位，觀察到骨量明顯增加，同時(shí)支架降解緩慢。增加支架的粗糙程度可提高細(xì)胞的黏附能力，將聚乙二醇分子上修飾RGD及PHSRN，3D打印出含有成骨細(xì)胞的生物支架體外培養(yǎng)，黏著斑染色觀察到成骨細(xì)胞黏附數(shù)目增加。聚合材料支架在增加新骨生成、促進(jìn)細(xì)胞黏附方面有很大優(yōu)勢(shì)，但是與細(xì)胞混合打印的高分子支架抗壓能力較弱，不能達(dá)到人體骨的抗壓要求。同時(shí)聚合材料降解產(chǎn)生酸性產(chǎn)物，降低局部pH值，會(huì)引起炎癥反應(yīng)；局部環(huán)境pH值降低可加速聚合材料酯鍵水解，促進(jìn)聚合材料降解，影響支架生物力學(xué)作用。

1.4 復(fù)合材料支架

為更大程度上滿足3D骨打印支架的需求，聚合材料與陶瓷或者金屬與陶瓷混合制成的復(fù)合材料支架成為新的突破。結(jié)合陶瓷支架與聚合材料支架的優(yōu)點(diǎn)，如同骨組織中膠原與鈣鹽的有機(jī)結(jié)合，更接近真實(shí)的 骨基質(zhì)環(huán)境，被許多學(xué)者用于3D骨組織打印研究。聚合材料與陶瓷制成的復(fù)合材料抗壓能力增強(qiáng)，接近松質(zhì)骨力學(xué)性能。β－硅酸鈣／聚乙丙交酯復(fù)合支架 體外及在體研究均表現(xiàn)出促進(jìn)成骨及促進(jìn)組織血管新生的能力。在復(fù)合材料支架中添加生物活性物質(zhì)，如BMP－2、VEGF，可進(jìn)一步刺激支架內(nèi)血管、骨量的增加，因此，包被生物活性分子的復(fù)合材料將成為3D骨打印支架的最佳選擇。

2. 3D打印骨支架的多孔結(jié)構(gòu)與微環(huán)境

在臨床中大量骨組織移植后，氧氣及營(yíng)養(yǎng)供給不足是移植后成活率降低的重要原因之一?？晒┲踩爰?xì)胞利用的氧氣在幾小時(shí)內(nèi)就被消耗殆盡，而局部血管新生傳送氧氣和營(yíng)養(yǎng)需要幾周的時(shí)間，即植入的大部分細(xì)胞在獲得足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)之前就可能失去功能或凋亡。3D打印骨組織的多孔結(jié)構(gòu)可持續(xù)提供氧氣與營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)可消除應(yīng)力屏蔽作用，且其表面形貌粗糙可促進(jìn)細(xì)胞黏附。

2.1 孔徑與孔隙率

3D打印多孔組織其孔徑大小、孔隙率及孔徑交聯(lián)度均影響細(xì)胞存活、組織長(zhǎng)入。Kuboki等1998年報(bào)道了移植物的多孔結(jié)構(gòu)可促進(jìn)骨再生，將噴涂有BMP－2的實(shí)體和多孔的羥磷灰石分別植入大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn) 實(shí)體羥磷灰石表面沒(méi)有骨生成，而多孔的羥磷灰石內(nèi)部有骨生成。Roy等2003年發(fā)現(xiàn)將附著有20％β－磷酸三鈣的聚丙交脂的多孔移植物，其孔隙率為80％～85％，孔徑為125～150μm，植入兔子的顱骨部位，發(fā)現(xiàn)形成 骨量較多。Karageorgiou等 2005年報(bào)道孔徑交聯(lián)可增加營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、細(xì)胞遷移、細(xì)胞橋連及組織長(zhǎng)入的能力。

2.2 血管新生

3D打印骨內(nèi)血管的新生會(huì)影響組織植入體內(nèi)后的功能重建，亦是衡量3D打印骨組織能否在臨床中應(yīng)用的重要標(biāo)準(zhǔn)。骨內(nèi)脈管系統(tǒng)可供給距離血管100μm以內(nèi)的組織的氧氣和營(yíng)養(yǎng)。有學(xué)者觀察到將嵌有細(xì) 胞的工程骨植入體內(nèi)，距離血管100～200μm范圍內(nèi)的細(xì)胞可獲得營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。也有學(xué)者觀察到將孔徑為 523μm、孔隙率為70％的聚己內(nèi)酯／磷酸鈣支架植入后，骨缺損部位新生血管明顯增加 。還有學(xué)者在孔徑為275μm、400μm的3D打印支架中均觀察到大量的新生血管，而支架孔徑為100μm時(shí)觀察到新生血管 相對(duì)較少 ，因此不同材料的多孔結(jié)構(gòu)支架中孔徑和孔隙率與打印骨組織內(nèi)血管新生及新生血管長(zhǎng)入的深度密切相關(guān)。

2.3 促進(jìn)成骨

3D打印骨組織的成骨性分化是衡量工程骨優(yōu)劣的主要指標(biāo)，多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)骨組織長(zhǎng)入。明膠共打印羥磷石灰圓柱形多孔支架促進(jìn)骨原細(xì)胞增殖，且在體研究發(fā)現(xiàn)交聯(lián)孔徑100～400μm、孔隙率75％的支架較適合骨原細(xì)胞增殖及成骨性分化。雙向磷酸鈣支架孔徑為300μm時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞 增殖能力強(qiáng)于磷酸三鈣支架。目前學(xué)者們均認(rèn)為多孔支架促進(jìn)成骨，但孔徑、孔隙率、交聯(lián)度是多少時(shí)最適合成骨，并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這可能與支架材料不同有關(guān)。

3. 3D骨以及其他細(xì)胞聯(lián)合打印

3D細(xì)胞打印技術(shù)是一種在體外將細(xì)胞定植于人造器官的特定位置、構(gòu)造三維多細(xì)胞體系的技術(shù)。生物體內(nèi)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)按照一定的空間結(jié)構(gòu)排列形成，細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中精確定位是維持生物結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能完整性的必要條件。3D骨組織打印將細(xì)胞與支架同時(shí)打印，利于在支架原位成骨，實(shí)現(xiàn)完美骨再生。目前用于3D骨組織打印的細(xì)胞主要有骨原細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞（脂肪、骨髓、間質(zhì)）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。

3.1 骨原細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共打印

骨原細(xì)胞具有成骨性分化能力，內(nèi)皮細(xì)胞有促進(jìn)血管新生能力。成骨性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共同打印于3D組織中，細(xì)胞間通過(guò)直接接觸、縫隙連接、自分泌／旁分泌等途徑，完成信息交流，促進(jìn)血管新生、骨組織形成。將人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞與人成骨肉瘤細(xì)胞MG－63細(xì)胞定植于3D打印骨組織中進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察到大量微血管樣結(jié)構(gòu)形成，分泌VEGF水平增加，細(xì)胞間粘連分子表達(dá)上調(diào)，同時(shí)MG－63細(xì)胞存活時(shí)間明顯增加。將HUVECs與人成骨細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，可檢測(cè)到VEGF、Ⅰ型膠原、粘連分子表達(dá)上調(diào)，同時(shí)堿性磷酸酶、骨鈣素、Runx－2等成骨性標(biāo)記表達(dá)明顯增加，但骨原細(xì)胞數(shù)量較少，增殖能力相對(duì)較低，不適合大量成骨。

3.2 成體干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共打印

成體干細(xì)胞具有多向分化潛能，且增殖能力比骨原細(xì)胞強(qiáng)，可用于3D骨細(xì)胞打印。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或脂肪衍生間充質(zhì)干細(xì)胞與HUVECs體外共培養(yǎng)可觀察到微血管樣結(jié)構(gòu)形成，而HUVECs單獨(dú) 培養(yǎng)不能形成微血管樣結(jié)構(gòu)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)初級(jí)成骨細(xì)胞與人內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，初級(jí)成骨細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、分泌VEGF等，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞衍生的血管新生。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MSCs與HUVECs體外共培養(yǎng)時(shí)，HUVECs抑制MSCs增殖及成脂肪性分化，并且HUVECs通過(guò)上調(diào)MSCs核內(nèi)β－鏈蛋白（β－catenin）及 pSmad1／5／8表達(dá)，激活其內(nèi)源性Wnt及BMP信號(hào)通路，促進(jìn)其成骨性分化。盡管干細(xì)胞具有多能分化特性，但如何精確調(diào)控其定向成骨分化，并配合血管新生，依然是該領(lǐng)域尚未解決的重要科學(xué)問(wèn)題。

3.3 胚胎干細(xì)胞打印

胚胎干細(xì)胞具有在體外培養(yǎng)中無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性，容易誘導(dǎo)成骨，被許多學(xué)者用于3D骨組織打印。將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)形成胚胎，取出間質(zhì)干細(xì)胞，種植在藻酸鹽微粒包被的碳酸鈣支架上，細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶、骨鈣素均增加，鈣鹽沉積明顯。若將人胚胎干細(xì)胞衍生的間質(zhì)干細(xì)胞，種植在RGD修 飾的CPC支架中，可顯著刺激成骨。胚胎干細(xì)雖然有很好的成骨分化特性，但其瘤變率仍無(wú)法避免，同時(shí)費(fèi)用也極其昂貴，且存在倫理問(wèn)題。

3.4 iPSCs細(xì)胞打印

iPSCs細(xì)胞是通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些轉(zhuǎn)錄基因?qū)塍w細(xì)胞內(nèi)，使體細(xì)胞直接重構(gòu)成為胚胎干細(xì)胞樣的多潛能細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上存在免疫排斥以及倫理窘境，學(xué)者正在嘗試用iPSCs細(xì)胞代替胚胎干細(xì)胞。將小鼠尾部成纖維細(xì)胞重構(gòu)為iPSCs細(xì)胞，用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β2處理后，iPSCs細(xì)胞RunX－2、OSX、OPN、OCN基因表達(dá)水平增加，將該細(xì)胞種植于羥基磷灰石／碳酸三鈣支架，在體研究發(fā)現(xiàn)iPSCs細(xì)胞表達(dá)骨鈣素增加。將iPSCs細(xì)胞種植在用血漿處理后的聚醚砜支架上，其表達(dá)堿性磷酸酶、骨鈣素顯著增加，植入大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)骨缺損部位新骨形成量多，愈合快。將人骨髓中CD34＋細(xì)胞用pEB－C5病毒轉(zhuǎn)染后重構(gòu)為iPSCs細(xì)胞，培養(yǎng)并種植在磷酸鈣支架上，發(fā)現(xiàn)iPSCs細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)，ALP、 RunX－2、Ⅰ型膠原等成骨基因表達(dá)水平顯著增加，骨鹽合成增多。將含有BMP－2基因的慢病毒轉(zhuǎn)染到iPSCs－MSCs，種植在碳酸鈣支架上，顯著促進(jìn)該細(xì)胞成骨性分化及骨鹽形成。雖然通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染添加“重新編程”基因或取代細(xì)胞中有缺陷基因的方法可能引起感染，且可能產(chǎn)生細(xì)胞瘤變，但是iPSCs技術(shù)不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞，無(wú)倫理學(xué)問(wèn)題，同時(shí)制備iPSCs細(xì)胞為患者體細(xì)胞，無(wú)免疫排斥問(wèn)題，且可制備的細(xì)胞數(shù)量充足。

4. 3D打印骨組織與生物降解

3D打印骨組織植入體內(nèi)促進(jìn)骨缺損部位功能重建，在骨骼功能重建過(guò)程中細(xì)胞產(chǎn)生新的基質(zhì)代替支架，最終達(dá)到骨組織缺損前的生理狀態(tài)，材料降解最理想的情況是新生基質(zhì)與材料降解的速度在時(shí)間、空間能夠同步，且打印組織材料降解不影響骨骼局部生物力學(xué)。Wang等 發(fā)現(xiàn)β－CS／PDLGA復(fù)合材料支架植 入家兔體內(nèi)，在4、12、26周時(shí)新骨形成分別是16．33％、28．7％、26．37％，支架降解率在4、20周分別是33．71％、65．72％，表明β－CS／PDLGA支架不但有骨誘導(dǎo)效應(yīng)、促進(jìn)骨形成，且該支架降解率更接近新骨形成速度。 Wang等將骨傳導(dǎo)性好的β－磷酸三鈣與骨誘導(dǎo)性好的β－CS制成混合型多孔生物陶瓷支架，植入股骨缺損部位，發(fā)現(xiàn)β－磷酸三鈣與β－CS比例為1∶1時(shí)，在第4、12、26周新骨形成量是19．54％、30．00％、23．55％，相應(yīng)支架降解率分別為19．48％、52．36％、66．81％，即該支架降解與新骨形成接近同步，這樣骨組織形成與支架降解在時(shí)間、空間上幾乎同步進(jìn)行，能夠促進(jìn)骨組織局部缺損更快愈合。

隨著研究的深入，骨組織3D打印在骨移植方面的潛能受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注，現(xiàn)有的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨組織3D打印在提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣、生物力學(xué)、細(xì)胞成骨性分化、支架降解等方面均有重要作用。骨組織3D打印在骨科具有十分廣泛的應(yīng)用前景，例如骨腫瘤切除后骨組織植入。北京大學(xué)第三醫(yī)院已完成世界首例用3D打印技術(shù)人工定制樞椎椎體治療寰樞椎惡性腫瘤的手術(shù)，該植入物為用鈦合金粉末3D打印出的樞椎，這標(biāo)志著3D打印技術(shù)已經(jīng)在脊柱外科臨床中應(yīng)用?；谏鲜鲅芯恐泄墙M織3D打印的優(yōu)點(diǎn)以及研究人員進(jìn)一步的努力和探索，骨組織3D打印將是骨再生的未來(lái)。